猪链球菌对大环内酯类药物耐药性研究进展

摘　要：随着养业的迅速发展，链球菌病也在世界范围内广泛传播。大环内酯类药物在养业中的广泛应用也使其耐药性随之产生，国内外链球菌对大环内酯类的耐药性较严重，耐药率达50%以上。目前国内外已报道的链球菌对大环内酯类耐药基因包括ermA、ermB、ermC和mefA，其中最常见的是ermB基因编码的内在型(cMLSB)耐药。大环内酯类耐药性特点表现为多重耐药株(MDR)占很大比例且与菌株血清型之间可能存在相关性。耐药基因erm及mef均为获得性耐药基因，位于转座子内，或由质粒携带，可在细菌间广泛传播。合理使用抗菌药物，加强耐药性监测，开发新药以及等对于减缓耐药性的产生和传播具有十分重要的意义。

关键词：链球菌；大环内酯类药物；耐药机制

随着养业的迅速发展，链球菌病也在世界范围内广泛传播，尤其在养业发达的地区，链球菌病发病率也越高。该病是由多种溶血性链球菌引起的一种多型性疫病，对易感群可导致败血症，引起突然死亡，给养业造成了巨大的损失[1]。该病的防治手段主要是使用药物和，在临床主要应用的大环内酯类药物有红霉素和泰乐菌素[2]。近年来，随着大环内酯类药物在养业的广泛应用，链球菌对大环内酯类药物的耐药株也迅速发展，耐药率持续增加。

1　链球菌对大环内酯类药物耐药状况

由于大环内酯类药物对革兰阳性球菌和支原体有广谱的抗菌活性，毒副作用小，价格低廉，不仅在人医临床上作为一线用药或联合用药制剂，而且在临床上也广泛应用。近年来一些国家均报道链球菌对大环内酯类药物的耐药性呈上升趋势，存在不同的耐药机制和耐药表型，且表现为多重耐药，从而对该病的治疗构成了严重的威胁。

1998年至2003年分离自江苏、上海、杭州等地的38株源链球菌及2株德国、丹麦株的药敏试验结果显示，链球菌对红霉素、罗红霉素、泰乐菌素及替米考星的耐药率分别达72.5%、67.5%、72.5%和62.5%[3]。2000年至2001年分离自长春地区不同场的22株链球菌的耐药性试验表明，对红霉素和阿奇霉素耐药率均为86%[4]。分离自河南省15个县、市33株链球菌对红霉素耐药率为78.8%[5]。上海、沈阳、吉林、长春分离的36株链球菌对阿奇霉素耐药率为86.1%[6]。检测常用抗菌药物对东北地区源链球菌的体外抗菌活性，发现对大环内酯类/林可酰胺类药物耐药率高达82%～100%[7]。对浙江部分地区屠宰场38株链球菌耐药情况进行调查，表明对红霉素、麦迪霉素耐药菌株分别为57.9%和81.6%[8]。Martel A等[9]检测了87株1999年至2000年分离的链球菌，其中71%的菌株对多种大环内酯类/林可酰胺类药物表现高耐药性。Vela A I等[10]对151株分离自西班牙的链球菌进行药敏试验，发现超过87%的分离株对大环内酯类和林可酰胺类药物耐药。

通过以上数据可以看出，国内外链球菌对大环内酯类耐药严重，耐药率均达50%以上。近年来由于大环内酯类药物的大量应用，以及长期在中添加亚治疗剂量该类药物，增加了药物对细菌的选择性压力，亦加速了细菌耐药性产生[11]。

2　链球菌对大环内酯类药物耐药机制

大环内酯类抗菌药物通过结合细菌核糖体靶位点50 S亚基，促使肽酰tRNA在移位的过程中从核糖体上脱落下来，而阻碍细菌蛋白质合成[12]。链球菌对大环内酯类耐药通常是由于核糖体靶位改变以及外排泵介导的药物外流。

2.1　核糖体靶位改变

核糖体靶位改变包括甲基化酶修饰、核糖体大亚基23 S rRNA/蛋白质突变及抗性短肽所引起的抗性[13]。其中甲基化酶引起的靶位改变最常见，由Erm家族催化23 S rRNA上单个腺嘌呤残基甲基化，导致核糖体构象发生改变，可显著**大环内酯类药物与靶位点的亲和力。链球菌中主要的编码甲基化酶耐药的是ermB基因和ermA基因。因大环内酯(M)、林可酰胺(L)及链阳菌素B(SB)的作用部位相仿，所以耐药菌对这三类药物常交叉耐药，称为MLSB(macrolide-lincosamide-streptogramin B)耐药。由erm基因介导的MLSB耐药可分为内在型耐药(cMLSB)和诱导型耐药(iMLSB)。内在型由于翻译弱化系统的碱基发生改变，使erm基因mRNA有活性，能被核糖体翻译，导致核糖体在合成时甲基化。在诱导剂存在或不存在情况下对MLSB类抗生素具有同等程度的耐药。诱导型erm基因的mRNA不具活性，仅在可产生诱导的大环内酯类抗生素存在条件下被激活，翻译erm甲基化酶表达耐药[14]。在链球菌，诱导剂除14、15元环大环内酯外，还包括16元环大环内酯和林可酰胺类，iMLSB耐药菌对14、15元环大环内酯类耐药而对16元环大环内酯、林可酰胺及奎奴普丁仍敏感(部分菌株对16元环大环内酯和林可酰胺也耐药)[15]。

2.2　主动外排系统

在链球菌中，由mef基因编码产生一个能量依赖的外排蛋白，可将药物泵出细胞外[16]。该机制提供一种新的耐药表型即M表型，对14、15元大环内酯低水平耐药(最小抑菌浓度MIC 1 μg/mL～32 μg/mL)，对16元环大环内酯、林可酰胺及链阳菌素B敏感。mef基因有mefA和mefE两种，两者在核苷酸水平上具有90%的同源性[16]。

链球菌对大环内酯类耐药基因主要由甲基化酶基因ermB、ermA和外排泵基因mefA编码，均为获得性耐药，位于转座子或质粒上，可在不同种属细菌间传播。尚未在链球菌发现23 S rRNA/核糖体蛋白突变引起的耐药，该耐药机制在肺炎链球菌、葡萄球菌及A群链球菌中均有报道。目前国内外已报道的链球菌大环内酯类耐药基因包括ermA、ermB、ermC和mefA，其中最常见的是ermB基因编码的内在型(cMLSB)耐药，iMLSB和M型耐药菌株的比例尚不高。如王丽平等[17]研究国内临床分离的111株链球菌耐药性表明，ermB基因检出率为85.5%，cMLSB耐药表型占81.6%，M型和iMLSB型耐药分别为6.6%和11.8%。杨建江等[18]对长春地区22株链球菌临床分离株均扩增出ermB基因，而未扩增出mefA/E基因，cMLSB耐药表型达86%，未检测到M型耐药，提示链球菌M型耐药所占比例非常低。这与Martel A等[9]的研究结果一致。

3　链球菌对大环内酯类耐药的特点

3.1　多重耐药

大环内酯类耐药链球菌中多重耐药株(MDR)占很大比例，通常为四耐(同时耐4种药物)以上。药敏试验表明长春地区链球菌分离株MLSB类耐药率91%，多重耐药率为(对MLSB类、四环素类、氟喹诺酮类、氯霉素类、氨基糖苷类)82%[4]。王丽平等[19]检测了65株源链球菌对32种药物的耐药性，其中大环内酯多重耐药株占70%以上。Martel A等[9]检测了87株链球菌(1999年－2000年),71%的菌株对MLSB类耐药，85%的菌株对四环素类耐药。

我国链球菌对大环内酯/林可酰胺类耐药性高于丹麦、瑞典、日本等国家，且我国多药耐药情况更为严重[19]。研究表明，细菌长时间承受着多种抗生素选择的压力，因此，只有携带多种耐药决定子的细菌才得以生存，这些耐药决定子一般位于转座子中，可在不同菌种、菌株间传递，造成细菌对抗生素的普遍交叉耐药。Stuart J G等[20]在红霉素、克林霉素、四环素多重耐药链球菌中检测到一种类似Tn916的接合型转座子，携带红霉素、四环素等抗性基因。Martel A等[21]在携带ermB基因的链球菌中检测到tet基因及intTn1545基因，体外试验发现，ermB、tetO基因一同以较低频率在源和人源链球菌之间转移。

3.2　血清型相关性

链球菌根据菌体荚膜抗原特性的不同，分成35个血清型。研究发现，大环内酯类耐药性与菌株血清型之间可能存在相关性。

分离自丹麦的链球菌对大环内酯类药敏试验发现，1967年－1982年2型分离株全部为敏感，7型23.3%耐药，1992年－1997年2型分离株20.4%耐药，7型44.8%耐药[22]。另一项来自丹麦1995年67例和1996年31例链球菌的报道，2型链球菌中9.7%对林可霉素耐药，12.9%对螺旋霉素耐药，其他血清型链球菌中56.8%对这两种抗菌药物耐药[23]。分离自西班牙的151株链球菌，9型链球菌对泰乐菌素耐药性显著高于2型链球菌(前者耐药率94%，后者耐药率77%)[10]。以上数据，可能反映了菌株间抗生素选择压力及获得耐药性能力的差异。

耐药性与血清型相关性研究对链球菌分子流行病学研究具有很重要的意义，此外，耐药性与生化特性、致病性等的关系有待于进一步研究。

4　耐药基因传播机制

分析源链球菌耐药性产生的原因，除抗菌药物长期应用导致的“选择性压力”筛选和抗菌药物的不合理使用外，耐药基因在菌株间的广泛传播至关重要。链球菌大环内酯类耐药基因定位于质粒或转座子上，如在A、B、C、D和G群链球菌中发现编码MLSB耐药的质粒(17 Mdal～20 Mdal，同源性78%～95%，接合型或非接合型)，宿主范围很宽(可在种内及种间、属间转移)。又如在一株粪链球菌的多重耐药质粒上，MLSB耐药基因定位于一个3.3 Mdal的转座子Tn917上[24]。

细菌耐药可分为天然耐药和获得性耐药。链球菌大环内酯类耐药基因erm及mef均为获得性耐药基因，位于转座子内，或由质粒携带，可在细菌间广泛传播。Stuart J G等[20]在大环内酯类耐药链球菌中检测到非依赖质粒的接合型转座子(类似Tn916)，携带红霉素和四环素抗性并以一定的频率在源和人源链球菌间传递。对29株扁桃体及鼻腔中不同种属细菌的ermB基因进行测序，其中12株菌的ermB序列相同，其余菌株序列只有1个～6个核苷酸的不同[25]。检测6株链球菌ermB基因同源性，与 GenBank中的肺炎链球菌Tn1545转座子、屎肠球菌的质粒pRUM786等的序列同源性为 98%～100%[18]。通过体外试验证明，ermB耐药基因(位于Tn1545上)在链球菌和人肺炎链球菌、化脓链球菌等之间以较低的频率进行交换[21]。

畜牧业生产中大量使用抗生素进行动物疾病防治，尤其药物广泛应用等都促进了细菌耐药的发生与传播。细菌对某种抗生素的固有耐药是其天然特性，耐药变异是细菌适应环境进化的结果。在抗生素选择压力下，质粒和与之相关的转座子使耐药性的转移和传播更加迅速，水平获得耐药基因的亚群可发展成优势菌群并将其垂直遗传给子代。因此，合理使用抗菌药物，加强耐药性监测，开发新药以及等对于减缓耐药性的产生和传播具有十分重要的意义。