兽药免疫检测的研究进展

近年来，随着我国畜牧业的发展，兽药的使用日益广泛，在动物性食品中具有不同程度的残留，对人类健康和环境造成了危害。因此，监控动物性食品中曾药的残留至关重要，传统的检测方法主要为气相色谱和高效液相色谱法，尽管这些方法的灵敏度和可靠性均很高，但其样品制备的程序比较复杂，难以适应市场产品的现场抽查、生产企业的自查及产品进出口**通关检测的要求。免疫检测技术具有特异性强、简单**、灵敏度高、成本较低的特点，可作为色谱分析方法的补充和半定量筛选及定量分析的工具。目前，比较常用的兽药免疫检测方法有酶联免疫吸附检测(ELISA)、荧光偏振免疫检测(FPTA)和胶体金免疫层析检测(GICA)等。

1  酶联免疫吸附检测

    酶联免疫吸附检测是将抗原或抗体吸附到固相载体上作为一种试剂来检测标本中有无相应的抗体或抗原的一种分析方法。加入某种酶标记的抗体或抗原，洗涤除去未结合物，再加入该酶的底物，使酶催化底物生成有色产物，产物的量与标本中待检物的量有关，通过与标准曲线比较，**得出样品中兽药的残留量。该方法是兽药免疫检测技术发展过程中最初使用的方法，也是最常用的方法，具有简单**、技术要求不高、易于推广等优点。Pastor-Navarro N等利用自制的抗四环素类多克隆抗体建立并优化了一种检测四环素类的间接竞争的酶联免疫吸附检测，四环素的**检测限为0.4ng/mL，吡甲四环素、土霉素、甲烯土霉素、氯四环素的交叉反应率分别为91%、30%、14%、10%；在蜂蜜样品中添加0.01～10000μg/L四环素，平均回收率的变化范围为79%～108%。Jin Y等使用抗庆大霉素单克隆抗体建立了直接竞争酶联免疫吸附检测用于检测动物血浆和牛奶中的庆大霉素，在直接竞争酶联免疫吸附检测中，检测磷酸盐缓冲溶液(PBS)、血浆、牛奶中庆大霉素的**检测限分别为0.9ng/mL、1.0 ng/mL、0.5ng/mL；在血浆和牛奶中添加25～100ng/mL的庆大霉素，增强样品的回收率变化范围为85%～112%。Jeon M等建立了生物素-亲和素介导的间接竞争酶联免疫吸附检测以检测牛奶中的四环素残留，优化后**检测限为0.048μ g/L，检测范围为0.15～150μg/L；氯四环素、土霉素交叉反应率分别为13.7%和10%，强力霉素的交叉反应率不超过1%；在牛奶中添加四环素，样品的回收率为90%。

2  荧光偏振免疫检测

    酶联免疫吸附检测具有很多优势并且能直接检测样品，其检测限可与仪器分析方法的检测限相近，甚至更低，但酶联免疫吸附检测需要很长的时间来分离游离的分析物和结合抗体的分析物，还需要多次的冲洗步骤。而荧光偏振免疫检测较为简单和**，不需要分离和冲洗步骤，它是基于游离和结合物中荧光标记物的偏振程度差别来达到检测目的的。游离的分析物**旋转，发射的光出现轻微程度的偏振；抗体一标记复合物具有很高的分子质量(>150000u)，因此旋转慢，导致其发射的荧光具有很高程度地偏振。游离的分析物与标记物添加至系统中竞争结合抗体，导致偏振程度**，通过与标准曲线对照，**得出兽药的含量。Shim W B等利用自制的抗6－氯烟酸多克隆抗体和荧光素标记的6－氯烟酸衍生物建立了定量检测6－氯烟酸的荧光偏振免疫检测法，其**检测限为4μg/mL，IC50为32μg/mL；5-氨基-氯噻吡二胺的交叉反应率为60%，但其他

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没有交叉反应。在苹果、尿液、土壤和水中添加5，50，500μg/mL 6-氯烟酸，其样品回收率为(78.6±8.8)%～(114.0±18.0)%。Wang Z H等使用自制的抗马度米星多克隆抗体建立并优化了检测马度米星的荧光偏振免疫测定法，检测范围为0.01～5.6μg/mL，IC50为0.16μg/mL，**检测限为0.002μg/mL；在鸡肉、脂肪和鸡蛋样品中添加0.25，5，10μg/g的马度米星，其回收率为82%～130%。

3  胶体金免疫层析检测

    酶联免疫吸附检测与荧光偏振免疫检测通常是在实验室内进行，不适于现场自测。胶体金免疫层析试纸条是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，当样品与纤维材料上相应的抗体相结合产生免疫反应并滞留或富集在检测区域时，通过反应物而出现呈色现象。胶体金免疫层析试纸条具有体积小、携带方便、不需要仪器设备、操作简单、可进行现场检测等特点，是一种定性、半定量检测方法，适用于药物残留的**初筛。Zhu Y等利用一种具有广谱特异性的单克隆抗体建立了一种可检测12种氟喹诺酮类兽药的胶体金免疫层析试纸条法，在鸡肉和鸡肝样品中添加诺氟沙星和培氟沙星，其**检测限均为25ng/mL；其他10种氟喹诺酮类兽药(恩氟沙星、环丙沙星、氟甲喹、氧氟沙星、洛米沙星、依诺沙星、达氟沙星、氨氟沙星、奥索利酸、马波沙星)的**检测限均为50ng/mL。Chen Y Q等人利用自制的单克隆抗体建立一种检测卡那霉素和妥布霉素的胶体金免疫层析试纸条法，使用该法检测磷酸盐缓冲溶液、肝脏、肾脏的卡那霉素和妥布霉素，**检测限分别为5ng/mL，50μg/kg，100μ g/kg。

4  展望

    我国动物性食品中的兽药残留严重超标，影响人民的身体健康，甚至已成为制约我国食品质量与国际竞争力的重要因素。目前，兽药的免疫检测技术已经成为传统仪器检测分析的辅助和替换方法。随着细胞融合技术、DNA重组技术、单链重组抗体技术和噬菌体展示技术等抗体制备技术的飞速发展，人们开始用基因工程的方法制备基因重组抗体。基因工程抗体的研制与发展为新一代抗体的制备与应用展示了广阔的前景。因此，兽药免疫检测技术以其自身的优势和方法上的不断完善，必将在兽药残留**监测领域发挥愈来愈重要的作用。