鸡沙门氏菌的分离与鉴定

摘 要：对昆明某种场发生的沙门氏菌病病进行病料的分离、鉴定以及禽场环境的监测，确诊禽场群感染的沙门氏菌菌群种类是白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和尚待进一步定群、定型的C菌株。药物敏感性试验结果表明，硫酸卡那霉素、菌必治、新霉素、多粘菌素B、环丙沙星等为高度敏感性药物。关键词：控制方法；鉴定；分离；场；沙门氏菌1引言目前我国市场不规范，变质、假货、劣货屡见不鲜。据陈明非等报道某场因改进配方，在种育成期、产蛋期的中添加肉骨粉替代植物性蛋白，事先未对样品进行沙门氏菌检测，结果不慎购入大批污染了沙门氏菌的肉骨粉，造成种阳性率大增，种蛋孵化率、健雏率下降的情况。定期检疫沙门氏菌的**措施。本实验通过对昆明某种场的病料、泄殖腔拭子、粪便、饲槽饮水、污水、新鲜蛋、、舍空气等样品进行细菌分离、鉴定，摸清场沙门氏菌感染种类。2材料与方法2.1材料2.1.1样品来源昆明某种场：病雏3只、成年发病蛋3只。病料取心、肝、脾、肾、胆囊、畸形卵细胞、部分输卵管。雏泄殖腔拭子20只份、成年蛋泄殖腔拭子20份。雏粪20只份、成年蛋粪20只份。雏饲槽饮水5份、成年蛋饲槽饮水5份、污水5份。新鲜蛋10个。空气取样：雏舍S.S琼脂培养皿打开3～5**取样5份、成年蛋舍S.S琼脂培养皿打开3～5**取样5份。取样5份，其中雏料3份、蛋料2份。血清样品：场随机抽取68日龄海兰蛋血清50只份、440日龄依莎蛋血清50只份。2.1.2培养基营养肉汤培养基（肉水1000毫升、蛋白胨10克、氯化钠5克）。普通营养琼脂（肉水1000毫升、蛋白胨10克、氯化钠5克、琼脂20～30克）。S.S琼脂（眎胨5克、乳糖10克、胆盐8.5～10克、柠檬酸钠0.5克、牛肉膏5克、琼脂20克、0.5%中性红水溶液4.5毫升、0.1%煌绿溶液0.33毫升、蒸馏水1000毫升）。三糖铁培养基（牛肉浸膏3克、枸椽酸铁0.3克、酵母膏3克、葡萄糖1克、蛋白胨20克、酚红0.024克、氯化钠5克、硫代硫酸钠0.3克、乳糖10克、琼脂12克、蔗糖10克、水1000毫升）。煌绿蛋白胨增菌液（0.5%氯化钠和1%蛋白胨的蛋白胨混合液混合，调整pH为7.0灭菌待用；1:10000煌绿水溶液。使用时取10毫升蛋白胨液加入各试管中，再加入0.4毫升的1:10000煌绿水溶液）。鲜血琼脂（无菌取健康家兔血液，加到盛有无菌5%柠檬酸钠的容器中，一般血液与5%柠檬酸的比例约为9：1，混匀，置冰箱中保存。将灭菌的营养琼脂冷却至45～50℃时，加入无菌鲜血达5%，混匀，无菌倾注于平皿）。糖、醇发醇管（蛋白胨1克、氯化钠0.5克、蒸馏水100毫升，所需的葡萄糖、鼠李糖、蕈糖、乳糖、蔗糖和甘露醇、卫茅醇、肌醇、山梨醇分别加入0.5～1克，1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1毫升）。尿素发酵管（蛋白胨1克、葡萄糖1克、氯化钠5克、磷酸二氢钾2克、蒸馏水1000毫升、0.4%酚红溶液3毫升、20%尿素100毫升）。枸椽酸钠发酵管（枸椽酸钠1克、氯化钠5克、K₂HPO₄1克、琼脂20克、硫酸镁0.2克，NH₄H₂PO₄1克、1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10毫升、蒸馏水1000毫升）。蛋白胨水（蛋白胨1克、氯化钠0.5克、蒸馏水200毫升）。硫化氢试验培养基（肉汤琼脂100毫升、10%硫代硫酸钠溶液2.5毫升、10%醋酸铅溶液3毫升），以上发酵培养基按要求实验室自制。2.1.3革兰氏染色液结晶紫染色液（甲液：结晶紫2.0克、95%乙醇20毫升；乙液：草酸铵0.8克、蒸馏水80毫升。使用时将甲液稀释5倍，即加20毫升甲液于80毫升乙液中，混合即成），按要求实验室自制。革兰氏碘溶液（碘片1克、碘化钾2克、蒸馏水300毫升。先将碘化钾加入3～5毫升蒸馏水中，溶解后再加碘片，用力摇匀，使碘片完全溶解后，再加蒸馏水至足量），按要求实验室自制。95%的酒精（用作脱色剂）。沙黄复染液（2.5%番红纯酒精溶液10毫升、蒸馏水90毫升，混合即成），按要求实验室自制。2.1.4药敏试纸购自渐江省军区后勤部卫生防疫检验所；沙门氏菌A-F群O多价血清购自兰州生物制品研究所（批号：20030301）；白痢伤寒多价抗原。2.1.5健康14日龄雏16只。

2.2方法2.2.1涂片镜检取肝、脾、肾组织直接涂片，革兰氏染色（结晶紫染色1～2**，水洗后加碘液助染1～2**，水洗后95%脱色半**，水洗后沙黄染液重染0.5～1**，水洗、滤纸吸干），用10×100倍油镜检查，均未见典型细菌。2.2.2增菌培养发病雏和成年蛋增菌培养：取肝、脾、异常卵泡、输卵管1～2克，剪碎后，分别放入装有10毫升煌绿蛋白胨增菌液的试管中，于37℃温箱中培养24**。雏和成年蛋泄殖腔拭子增菌培养：将火柴棍棉球泄殖腔抹拭物无菌操作放入装有5毫升煌绿蛋白胨增菌液的试管中，于37℃温箱中培养24**。雏粪增菌培养：取粪样品1份加到9份煌绿蛋白胨增菌液中，于37℃温箱中培养24**。雏饲槽饮水、蛋饲槽饮水、污水增菌培养：取2毫升水样放入8毫升煌绿蛋白胨增菌液中，37℃温箱培养48**。新鲜蛋增菌培养：取10个新鲜蛋，用碘酒将蛋壳表面消毒，打破蛋壳，把蛋清和蛋黄全部倒入装有玻璃珠的瓶内摇匀，取出30毫升接种在150毫升煌绿蛋白胨增菌液中，于37℃温箱中培养48**。增菌培养：无菌称取3份雏料、2份蛋料，分别置于225毫升煌绿蛋白胨增菌液中，于37℃温箱中培养48**。2.2.3分离培养取各增菌培养物划线接种到S.S选择培养基上，37℃温箱培养24**。2.2.4沙门氏菌初步确认采用平板凝集法。用接种环圈蘸取沙门氏杆菌A-F群O多价血清至玻片上3～4环，再用接种棒挑取S.S培养基分离典型菌落少许混匀，并用生理盐水和大肠杆菌作对照比较，观察是否出现絮状凝集沉淀，从而初步筛选出沙门氏菌。2.2.5纯培养挑取筛选出的沙门氏菌落，接种到三糖铁培养基上，于37℃温箱培养24**。2.2.6运动性检查采用压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查各菌株细菌运动性。其中悬滴检查方法为：取洁净的凹玻片一块，于其凹窝的四周整齐地涂以适量的凡士林。另取洁净盖玻片一块，用接种环于其中央滴上一小滴生理盐水或透明肉汤，再用接种环取待检团体培养物少量，混匀于液滴内；取起并翻转盖玻片，使液滴向下，以其对角线垂直于载玻片四边的位置，轻轻盖在凹玻片的凹窝上，略加轻压，使盖玻片四周与凡士林密着，封闭凹窝，**进行镜检。镜检时显微镜要放在平坦、稳固之处，不能倾斜或震动，放上悬滴标本片后，先用低倍镜找到液滴，移至视野中央，然后转换高倍镜和调查光线稍暗，对焦观察。半固体培养基穿刺培养法为：以灭菌接种针蘸取纯培养物，垂直穿刺接种于半固体培养基的琼脂柱中，置37℃温箱中培养18～24**，然后取出检查。平板挖沟培养法：以无菌操作在平板中心横过挖去一条1厘米宽的琼脂条，使平板中间形成一条小沟，放置一条4×0.5厘米的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，置37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至七天。如接种端的隔沟对边也生长出同样细菌，则表示该菌有运动力。2.2.7生化反应将各三糖铁培养基纯培养物挑取菌落接种于生化发酵管内，于37℃温箱培养后进行观察。结果见表1。2.2.8药敏试验将分离出的细菌接种于肉汤蛋白胨培养基，37℃培养48**，至肉汤变浑，试管底出现多量絮状沉淀。取菌汤2毫升覆盖在营养琼脂培养皿表面，倒弃多余菌液，将药敏试纸贴于培养基上，放入37℃温箱培养24**，测量抑菌圈大小。2.2.9白痢伤寒多价抗原血清学试验取场采集的68日龄海兰蛋血清50只份和440日龄依莎蛋血清50只份30ml与白痢伤寒多价抗原30ml在玻片上混合，轻轻摇动玻片，数**后出现絮片状凝集者为阳性。2.2.10动物接种试验将A菌株、B菌株和C菌株的普通营养琼脂平板培养物用生理盐水洗下后制成菌悬液，采用滴鼻和口服方法进行动动。

3结果3.1**采集样品分离、鉴定出的菌株分离率、菌株种类见表1。表1样品分离、鉴定出的菌株分离率、菌株种类

3.2培养特征、形态及染色特性、运动性检查3.2.1 A菌株将纯培养物分别接种在普通琼脂、鲜血琼脂、S.S琼脂、营养肉汤培养基中经37℃培养24**后，在普通琼脂平板上长出圆形、边缘整齐、湿润、稍隆起的光滑菌落，单在3.2mm、密集1mm左右。在鲜血琼脂平板上菌落特点与普通琼脂平板上相同，其大小、形状与鲜血平板相同；在营养肉汤中肉汤轻度混浊，管底有絮状沉淀，无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检，见有革兰氏阴性细长杆菌（0.3～0.4um×1.2～2.2um），无芽胞及芙膜。经压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查，均无运动性。3.2.2B菌株将纯培养物分别接种在普通琼脂、鲜血琼脂、S.S琼脂、营养肉汤培养基中经37℃培养24**后，在普通琼脂平板上长出圆形，稍隆起、闪光而边缘无滑的菌落，大小1.5～1.8mm，在鲜血琼脂平板上菌落特点与普通琼脂增板上相同，未见溶血现象；在S.S琼脂上生长出无色半透明，中心带黑色的菌落，其大小、形状与鲜血平板相同；在营养肉汤中肉汤中度混浊，管底有絮状沉淀，无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检，无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检，见有革兰氏阴性0.6～1um×1.8um杆菌，单在或两个成链，无芽胞及芙膜。经压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查，均无运动性。3.2.3C菌株将纯培养物分别接种在普通琼脂、鲜血琼脂、S.S琼脂、营养肉汤培养基中经37℃培养24**后，在普通琼脂上长出圆形、稍隆起、边缘光滑的菌落，大小1mm，在鲜血琼脂平板上菌落特点与普通琼脂平板上相同，未见溶血现象；在S.S琼脂上生长出无色半透明菌落，其大小、形状与鲜血平板相同；无菌膜及菌环。纯培养物进行涂片染色镜检见有0.3～0.4um×1.3～2.5um杆菌，单在，无荚膜、无芽胞。经压滴法、悬滴法、半固体穿刺培养法及平板挖沟培养法检查，均无运动性。3.3禽场白痢、伤寒多价抗原血清学监测68月龄海兰蛋检测50只份血清阳性6只份，阳性率12%。440日龄依莎蛋检测50只份，阳性5份，阳性率10%。3.4生化试验结果分离出的A菌株发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、蕈糖、甘露醇、卫茅醇、枸椽酸盐；不发酵乳糖、蔗糖、肌醇；靛基质阴性、V-P阴性、M·R阳性，产生硫化氢、过氧化酶阴性。分离出的B菌株发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、蕈糖、甘露醇；不发酵乳糖、蔗糖、肌醇；靛基质阴性，V-P阴性，产生硫化氢。分离出的C菌株发酵葡萄糖、尿素，不发酵乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、枸椽酸盐、卫茅醇、硫化氢阴性，V-P阴性、过氧化酶阴性。3.5药敏试验结果分离菌株药敏试验结果见表2。表2 药敏试验结果

3.6动物接种试验雏接种后第3天早上部分开始出现症状，随后其他试验雏相继出现症状，并与自然发病症状相同，其中A菌株较B菌株、C菌株症状严重。一周内统计灭亡病雏，A菌株试验组全部死亡，B菌株试验组死亡1只，C菌株试验组死亡2只，试验雏死后进行剖检，并取脏器涂片镜检和培养特性观察，结果与所分离菌株完成全致，滴服生理盐水对照组雏全部存活。4讨论与结论根据临床症状、病理剖检、病料的分离、鉴定以及禽场环境的监测，确诊禽场群感染的沙门氏菌菌群种类是白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和尚待进一步定群、定型的C菌株。药物敏感性试验结果表明，硫酸卡那霉素、菌必治、新霉素、多粘菌素B、环丙沙星等为高度敏感性药物。